摘要：肝脏微环境的维持不仅依赖于肝实质细胞，还离不开多种肝非实质细胞（NPCs）的协同作用。其中，肝星状细胞（HSCs）和肝窦内皮细胞（LSECs）是肝病研究、药物筛选及肝脏模型构建中最重要的细胞类型之一。本文围绕两类细胞的生物学特性、疾病研究价值及标准化培养方法进行系统介绍，为肝病机制研究与药物开发提供参考。
关键词：肝星状细胞、肝窦内皮细胞、肝非实质细胞、原代肝细胞培养、肝纤维化模型、药物肝毒性、人原代肝细胞、HSCs、LECs、Liver Sinusoidal Endothelial Cells、LSECs
肝脏微环境中的关键细胞：HSCs与LSECs的重要作用
肝脏作为人体最大的代谢器官，其正常功能依赖于肝实质细胞与肝非实质细胞（NPCs）的相互协作。其中，肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells，HSCs）和肝窦内皮细胞（Liver Endothelial Cells，LECs）是肝非实质细胞中最重要的组成部分。两者不仅参与维持肝脏微环境稳态，还深度参与肝纤维化、肝硬化、肝癌以及药物性肝损伤等疾病过程，因此已成为肝病机制研究、药物开发以及体外肝脏模型构建中的重要研究对象。
一、肝星状细胞（HSCs）：肝纤维化发生发展的核心细胞
1. 基本生物学特性
肝星状细胞位于肝窦周隙（Disse间隙），即肝细胞与肝窦内皮细胞之间的空间。在正常生理状态下，HSCs处于静息状态，其胞质中含有大量富含维生素A的脂滴，储存着机体约70%～90%的维生素A。静息状态下的HSCs主要负责维持维生素A代谢平衡、分泌正常细胞外基质（ECM）、参与肝细胞再生调控以及调节肝窦血流等功能。
当肝脏受到病毒感染、酒精损伤、代谢异常或慢性炎症刺激时，HSCs会被激活并逐渐转化为肌成纤维细胞样细胞。激活后的HSCs失去脂滴储存功能，开始大量增殖、迁移并分泌I型和III型胶原等异常细胞外基质，同时释放多种促炎及促纤维化因子，最终推动肝纤维化和肝硬化的发展，因此被认为是肝纤维化发生过程中最关键的效应细胞。
图1. 人肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells, HSCs）
2. 在疾病研究中的应用
HSCs的激活是肝纤维化形成的中心事件，因此在肝病研究中具有重要价值。研究人员常利用HSCs研究TGF-β/Smad、PDGF/ERK等经典纤维化信号通路，寻找新的抗纤维化治疗靶点；同时也可构建体外激活模型，用于筛选抑制HSCs增殖、胶原分泌或促进其凋亡的候选药物。此外，活化HSCs表面高表达PDGF受体及整合素等分子，也为肝靶向药物递送系统设计提供了重要依据。在肝癌研究领域，HSCs与肿瘤细胞之间复杂的相互作用同样是肝癌微环境研究的重要方向。
3. 人原代肝星状细胞标准化培养流程
3.1 细胞复苏
预热完全培养基至37℃，将冻存细胞从液氮中取出后快速解冻，随后转移至含培养基的离心管中，离心去除冻存液后使用预热培养基重悬细胞。
3.2 细胞铺板
细胞计数后按照约5000个细胞/cm²的密度进行接种。接种后应立即轻轻晃动培养皿，使细胞均匀分布，再置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。
3.3 细胞培养维护
培养期间每3～4天更换一次培养基，并持续观察细胞形态变化。静息状态HSCs呈星形，而激活后则逐渐转变为梭形。当融合度达到85%以上时可进行传代或冻存。
图2. 肝星状细胞P1代ICC分析表征图（200倍）
3.4 细胞消化与传代
使用PBS清洗后加入预热胰酶消化细胞，待细胞脱落后加入完全培养基终止消化，离心收集后按4500～5000个细胞/cm²密度重新接种。
3.5 细胞冻存
采用预冷冻存液重悬细胞，分装后经程序降温处理，于-80℃过夜后转移至气相液氮长期保存。
二、肝窦内皮细胞（LSECs）：肝脏微环境的重要守护者
1. 基本生物学特性
肝窦内皮细胞是构成肝血窦内衬的特殊血管内皮细胞，与普通血管内皮细胞相比具有明显区别。其最显著的特征是拥有大量直径约100～150 nm的窗孔结构，同时缺乏连续完整的基底膜，因此成为机体中通透性最高的内皮细胞之一。这种特殊结构使其成为肝脏与血液之间进行物质交换的重要门户。
除了物质交换功能外，LSECs还具有强大的内吞能力，能够清除循环中的大分子物质、病原体及衰老蛋白，因此常被称为肝脏中的“血液净化器”。此外，LSECs还能通过分泌一氧化氮（NO）等信号分子维持HSCs静息状态，对肝脏微循环和肝脏稳态具有重要意义。
图3. 肝窦内皮细胞（Liver Endothelial Cells, LECs）
2. 在疾病研究中的应用
越来越多研究发现，LSECs功能异常往往是肝病发生的早期事件之一。在肝纤维化过程中，LSECs会出现毛细血管化改变，即窗孔减少甚至消失，并形成基底膜，这一过程通常早于HSCs激活。与此同时，LSECs也是药物进入肝脏后的第一道屏障，其损伤常早于肝细胞，因此被广泛用于药物性肝损伤（DILI）研究和药物安全性评价。此外，LSECs表面表达的Stabilin-2及甘露糖受体等分子，也为肝靶向药物递送系统开发提供了新的研究方向。在MAFLD、MASH等代谢性肝病研究中，LSECs同样发挥着重要作用。
3. 人原代肝窦内皮细胞标准化培养流程
3.1 细胞复苏
将冻存细胞快速解冻后转入预热培养基中，离心去除冻存液后使用新鲜培养基重悬细胞。
3.2 细胞铺板
按照约5000个细胞/cm²的密度接种于培养皿中，并均匀分散细胞后置于培养箱培养。
3.3 细胞培养维护
培养期间每2～3天更换一次培养基，并通过显微镜观察细胞形态。正常LSECs通常呈典型鹅卵石样排列，当细胞融合度达到85%以上时可进行传代或冻存。
3.4 细胞消化与传代
使用PBS清洗后加入胰酶进行消化，待细胞脱落后终止消化，离心收集并重新接种培养。
3.5 细胞冻存
采用程序降温方式冻存细胞，随后转移至液氮中长期保存。
三、HSCs与LSECs共培养模型的研究价值
肝脏是一个高度复杂的器官，仅依赖单一细胞培养往往难以真实模拟体内环境。HSCs与LSECs共培养模型能够更好地重建肝脏微环境，从而提高疾病模型和药物评价体系的生理相关性。在肝纤维化研究中，LSECs毛细血管化能够诱导HSCs活化，更真实地模拟疾病进程；在药物筛选领域，共培养模型能够更准确地评估药物肝毒性和抗纤维化效果；在肝脏类器官构建过程中，将HSCs、LSECs、肝细胞及Kupffer细胞联合培养，还能够构建功能更完整的肝脏模型。
值得关注的是，目前部分研究资源可提供同一供体来源的HSCs、LSECs及Kupffer细胞，有助于减少供体差异带来的实验偏差，提升模型稳定性和实验重复性。相关肝非实质细胞资源及技术资料也可参考：
https://www.mine-bio.com/LifeNet_PrimaryCells_Medium/?utm_source=csdn&utm_medium=referral&utm_campaign=lifenet_article
FAQ：肝非实质细胞常见问题
Q1：原代HSCs和LSECs可以传代多少次？
A：由于原代细胞在体外培养过程中会逐渐发生表型变化，通常建议传代次数不超过3代，以保证实验结果的可靠性。
Q2：为什么HSCs接种后需要立即晃动培养皿？
A：HSCs贴壁速度较快，如果不及时均匀分散，细胞容易集中于培养皿中央，影响后续培养和实验结果。
Q3：如何判断HSCs是否被激活？
A：可检测α-SMA、I型胶原等活化标志物表达变化，同时观察GFAP等静息状态标志物的下降情况。
Q4：如何验证LSECs纯度和功能？
A：可通过CD31、vWF、LYVE-1等标志物检测细胞纯度，并结合乙酰化LDL摄取实验或扫描电镜观察窗孔结构评估其功能状态。
参考文献
[1] Schwabe RF, Brenner DA. Hepatic stellate cells: balancing homeostasis, hepatoprotection and fibrogenesis in health and disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2025.
[2] Chen G, et al. Endothelial RAP1A attenuates sinusoidal capillarisation and liver fibrosis by inhibiting RAF1-mediated Notch activation. Gut, 2026.
本文基于LifeNet Health、肝非实质细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、Liver Sinusoidal Endothelial Cells、LSECs的参考文献、应用技术文章等公开资料整理，并结合相关研究文献进行汇总，用于科研信息分享与实验参考。内容来源于用户提供原文资料。
