课前准备–蛋白-蛋白分子对接（二）-171主机测评

作者，Evil Genius

接下来要为我们的2026生化小课–CADD计算机辅助药物设计、分子对接/分子动力学的课程做好准备，这个世界上很多事情我们都无法决定，我们唯一确定能决定的事情，就是自己想做一件事，尽自己最大的努力把事情做好。

今天我们更新一下蛋白-蛋白分子对接，之前分享过一篇，在分子对接–蛋白蛋白对接,以PD-1/PDL-1为例，今天我们丰富一下这个内容。

其实别以为这样的内容离我们很远，其实很近，我们日常使用的注射制剂，很多都是蛋白制剂，都是通过算法 + 临床得来的，其实蛋白蛋白分子对接常用的就是抗原抗体，由此还形成了一个很大的学科，那就是蛋白设计，根据靶向蛋白分子，独立设计蛋白抗体，并且加上一些特殊的结构，达到治疗的目的。

先来看看蛋白蛋白相互作用。

生物体的生理功能主要由细胞中的蛋白质控制和调节。其中，多数蛋白质是作为蛋白质复合物中的一部分参与细胞的代谢过程。因此，研究蛋白质间的相互作用是理解生命活动的基础。

通常来讲，蛋白蛋白分子对接的方法ZDOCK的运用最多，这列给大家一个蛋白结构，大家可以跟着做一下：

从PDB数据库下载得到2019-nCoV的spike蛋白6VXX和ACE2蛋白晶体结构1R42，模拟它们的相互作用

在Pymol软件中准备蛋白1R42和6VXX，spike蛋白6VXX为多聚体，只保留B链，优化后分别输出文件1r42_minimize.pdb和6vxx_minimize.pdb

例如文献中的运用

一、先理解：ZDOCK到底在做什么？

假设我们有：

蛋白 A：PD-1
蛋白 B：PD-L1

我们希望得到：

PD-1 + PD-L1 → 最可能的结合复合物结构

ZDOCK的基本思想是：

PD-1结构
+
PD-L1结构
↓
ZDOCK刚性蛋白-蛋白对接
↓
产生大量候选复合物
↓
打分
↓
得到Top 10 / Top 20 / Top 100
↓
聚类
↓
人工分析结合界面
↓
得到候选PD-1/PD-L1复合物

和你之前做的 AutoDock Vina小分子对接相比，最大的区别是：

VinaZDOCK

对接对象	蛋白-小分子	蛋白-蛋白
配体	小分子	另一个蛋白
搜索空间	蛋白口袋	整个蛋白表面
柔性	有限	经典ZDOCK主要是刚性对接
输出	ligand poses	protein-protein complexes
核心问题	小分子如何进入口袋	两个蛋白如何贴合

二、实际案例：PD-1–PD-L1

我们假设：

Receptor：PD-1

Ligand：PD-L1

目标：

预测PD-1与PD-L1形成复合物时，两者的空间结合方式。

结构可以从 Protein Data Bank 获取。

例如可以搜索：

PD-1 PD-L1 complex PDB

经典PD-1/PD-L1复合物结构可以作为最终验证的参考结构。

这里有一个非常重要的实验设计思想：

不要直接拿完整PD-1/PD-L1复合物做ZDOCK

如果目标是测试ZDOCK预测能力，应该：

已知PD-1/PD-L1复合物
↓
拆开
↓
PD-1单体
+
PD-L1单体
↓
ZDOCK
↓
预测复合物
↓
与原始实验复合物比较

这叫做 docking re-docking / blind docking validation。

三、第一步：下载两个蛋白结构

例如得到：

PD1.pdb
PDL1.pdb

此时不要急着ZDOCK。

先检查PDB。

可以使用：

PyMOL
ChimeraX
Chimera
PDBFixer

例如PyMOL：

pymol PD1.pdb

观察：

PD-1
├── Chain A
├── ligand？
├── water？
├── antibody？
└── other chains？

四、为什么PDB不能直接扔进ZDOCK？

这是蛋白对接最容易出问题的地方之一。

实验结构PDB往往不是：

一个干净的蛋白

而可能是：

Protein
+
Water
+
Ion
+
Ligand
+
Antibody
+
多个Chain
+
晶体添加剂

例如：

ATOM
ATOM
ATOM
HETATM ← ligand
HETATM ← water
ATOM
ATOM

ZDOCK真正需要的是：

纯蛋白结构

所以需要预处理。

五、第二步：清理PDB

例如PD-1：

PD1_original.pdb

处理以后：

PD1_clean.pdb

PD-L1：

PDL1_original.pdb
↓
PDL1_clean.pdb

通常需要处理：

1. 删除水

例如：

HOH

删除。

2. 删除无关配体

如果PDB里面存在：

HETATM

要判断是不是需要保留。

对于普通蛋白-蛋白对接，一般删除无关小分子。

3. 保留正确的蛋白链

例如：

PD-1:
Chain A

PD-L1:
Chain B

最后最好得到：

PD1_clean.pdb
PDL1_clean.pdb

六、第三步：检查缺失残基

这是非常重要的一步。

比如PDB可能是：

1 2 3 4 5 6 7
A B C D E F G

但实际上：

1 2 3 5 6 7
A B C E F G

Residue 4缺失。

对于蛋白表面正好参与结合的位置，这可能严重影响对接。

可以使用：

PDBFixer
Modeller
ChimeraX
AlphaFold预测结构

补全。

七、第四步：准备ZDOCK输入

ZDOCK本质上需要两个蛋白：

Receptor
Ligand

例如：

Receptor = PD1_clean.pdb

Ligand = PDL1_clean.pdb

这里的“ligand”不是小分子意义上的ligand。

而是：

参与蛋白-蛋白对接的第二个蛋白。

八、ZDOCK的核心算法

ZDOCK不是简单地：

“把PD-L1放到PD-1表面随机旋转。”

它会进行大量空间搜索。

可以粗略理解成：

PD-L1
↓
旋转
↙ ↓ ↘
多个方向
↓
平移
↓
与PD-1碰撞检测
↓
计算score

数学上可以简单理解为：

不同版本/模式的具体打分组成有所不同。

其中最重要的几个概念：

Shape complementarity

两个蛋白表面是否互补。

类似：

蛋白A：

/\\__
___/ \\___

蛋白B：

___ ___
\\____/

如果：

凸 → 凹
凹 → 凸

匹配得比较好。

Electrostatics

例如：

PD-1表面：++++
PD-L1表面：—-

静电吸引有利。

反之：

++++
++++

通常不利。

九、第五步：开始ZDOCK

ZDOCK命令根据你安装的具体版本略有不同。

典型流程类似：

zdock -R PD1_clean.pdb -L PDL1_clean.pdb

或者使用ZDOCK提供的图形界面进行：

Receptor → PD1_clean.pdb
Ligand → PDL1_clean.pdb

然后：

Run ZDOCK

十、ZDOCK到底产生多少结果？

假设：

ZDOCK
↓
2000 poses

也就是说：

Pose 1
Pose 2
Pose 3
…
Pose 2000

这些全部都是：

PD-1 + PD-L1的不同空间排列。

例如：

Pose 1

PD-L1
███████
███████████
│
│
███████
PD-1

Pose 2

███████
████████
███████
███████
███

Pose 3

█████
█████████
████████
██████

当然真实结构是三维的。

十一、这里千万不要犯一个错误

很多初学者会认为：

ZDOCK排名第一 = 正确答案。

不一定。

这是蛋白-蛋白对接非常重要的一点。

例如：

ZDOCK Rank 1
score = 1785

Rank 2
score = 1779

Rank 3
score = 1768

Rank 4
score = 1759

并不能简单认为：

Rank 1 = 正确

原因是：

蛋白-蛋白对接存在大量局部最优解。

所以后面必须：

聚类 + 界面分析 + 生物学信息 + 结构评价

十二、第六步：对ZDOCK结果进行聚类

假设ZDOCK产生：

2000 poses

很多pose实际上非常相似。

例如：

Pose 1
Pose 8
Pose 13
Pose 27
Pose 43
Pose 87

它们可能都属于同一个结合模式：

Cluster 1

另外：

Pose 2
Pose 9
Pose 18
Pose 25

属于：

Cluster 2

所以：

2000 poses
↓
聚类
↓
Cluster 1
Cluster 2
Cluster 3
…

这一步非常重要。

因为：

一个稳定出现的大cluster，往往比单独一个高分pose更值得关注。

十三、为什么要看Cluster？

举一个极端例子。

模式A

Pose数量：

Cluster A = 320
Cluster B = 15
Cluster C = 8

模式B

最高score：
Cluster B中的某一个pose

虽然：

Cluster B

有一个最高分，但：

Cluster A

有大量相似结构。

这说明：

A可能是一个更稳定的结合模式。

所以ZDOCK结果不能只看：

score

而应该综合：

score
+
cluster size
+
interface
+
biological information

十四、第七步：用PyMOL查看ZDOCK结果

假设得到：

complex1.pdb
complex2.pdb
complex3.pdb

打开：

pymol complex1.pdb

然后：

PD-1
PD-L1

分别设置不同representation。

例如：

PD-1 → cartoon
PD-L1 → cartoon

然后查看interface。

你会看到：

PD-L1
█████████
███████████
||
|| interface
||
█████████
PD-1

十五、第八步：重点分析Interface

这一步实际上比“看ZDOCK分数”更重要。

我们需要问：

PD-1和PD-L1到底哪些氨基酸发生了相互作用？

例如：

PD-1

Residue 50
Residue 53
Residue 56
Residue 58

↓

PD-L1

Residue 115
Residue 118
Residue 120
Residue 123

可以分析：

1. Hydrogen bonds

PD1 residue
|
| H-bond
|
PDL1 residue

2. Salt bridges

例如：

Lys(+)
|
|
Asp(-)

3. Hydrophobic interaction

例如：

Leu
Ile
Val
Phe
Trp

形成疏水核心。

十六、可以进一步计算interface ΔG

例如使用：

Rosetta

或者：

PRODIGY
PISA
FoldX
Rosetta

来分析。

例如：

PD-1 + PD-L1

ΔGbinding = -12.4 kcal/mol

通常：

ΔG越负，预测结合越有利。

但注意：

不能简单把不同软件的ΔG直接横向比较。

十七、实际研究中我更推荐的流程

如果你不是为了学习，而是准备真正用于科研，我建议：

PDB
↓
蛋白结构预处理
↓
┌───────┴────────┐
↓ ↓
Protein A Protein B
↓ ↓
去水/配体去水/配体
↓ ↓
补缺失残基补缺失残基
└───────┬────────┘
↓
ZDOCK
↓
2000 docking poses
↓
Clustering
↓
Top 10–20 clusters
↓
界面分析
↓
┌──────┴──────┐
↓ ↓
生物学信息结构评分
↓ ↓
└──────┬──────┘
↓
Top 1–5 complexes
↓
Rosetta优化
↓
Molecular Dynamics
↓
RMSD/RMSF/Rg
H-bond/SASA
MM/PBSA或MM/GBSA
↓
最终候选复合物

十八、如果进一步结合你之前学习的PyRosetta

这个就非常有意思了。

你之前问过：

Vina对接以后为什么要用PyRosetta优化？

蛋白-蛋白对接也存在类似的问题。

ZDOCK本质上属于：

刚性对接

也就是：

PD-1结构不变
PD-L1结构不变

但是现实中的蛋白：

PD-1
↓
侧链可以转动
backbone也可能发生轻微变化

PD-L1
↓
侧链可以转动
backbone也可能发生轻微变化

所以ZDOCK得到的：

Rigid docking

可以继续：

ZDOCK
↓
PyRosetta local refinement
↓
Side-chain repacking
↓
Minimization
↓
Interface optimization

十九、ZDOCK + PyRosetta的完整思路

例如：

ZDOCK预测：

PD-1
████████
↓
████████ PD-L1

发现interface：

PD1-A52
PD1-Y56
PD1-M64

PDL1-L115
PDL1-F118
PDL1-Y123

然后PyRosetta进行：

① Side-chain repacking

重新寻找：

Rotamer

例如：

Tyr
↓
rotamer 1
rotamer 2
rotamer 3
rotamer 4

寻找更合适的侧链构象。

② Energy minimization

优化：

bond
angle
torsion
van der Waals
electrostatics

使interface更加合理。

③ Interface scoring

例如：

Before:

interface energy
= -25 REU

After:

interface energy
= -39 REU

说明局部优化后interface更加有利。

二十、再进一步做MD

如果你想做得更加完整：

ZDOCK
↓
Top 10 complexes
↓
PyRosetta refinement
↓
Top 3
↓
GROMACS
↓
100 ns MD

然后分析：

RMSD
RMSF
Radius of gyration
SASA
Hydrogen bonds
Salt bridges
Protein-protein contacts
MM/PBSA

例如：

ZDOCK
↓
2000 poses
↓
Cluster分析
↓
Top 10 poses
↓
PyRosetta refinement
↓
Top 3
↓
100 ns MD
┌────────┼────────┐
↓ ↓ ↓
RMSD H-bond MM/PBSA
↓ ↓ ↓
最终候选模型

二十一、特别重要：如果已知结合位点，千万不要盲目Blind Docking

假如你已经知道：

PD-1的binding residues：
A50
Y56
M64

那么可以把这些信息加入对接约束。

因为：

Blind docking

整个蛋白表面
↓
寻找结合位置

计算空间非常大。

而：

Site-directed docking

PD-1
↓
指定binding region

PD-L1
↓
指定binding region

搜索空间明显缩小。

二十二、如果是抗体–抗原，更应该这样做

比如：

抗体
+
HER2

如果已知：

CDR

那么应该重点关注：

CDR-H1
CDR-H2
CDR-H3
CDR-L1
CDR-L2
CDR-L3

而不是让抗体整个表面都参与随机对接。

流程：

Antibody
+
Antigen
↓
ZDOCK
↓
Interface constraint
↓
Cluster
↓
CDR interface
↓
PyRosetta refinement

二十三、你需要特别理解ZDOCK和Vina的区别

你前面已经在学习Vina，这两个可以放在一起理解：

分子对接
│
┌────────┴────────┐
│ │
小分子-蛋白蛋白-蛋白
│ │
Vina ZDOCK
│ │
ligand docking protein docking
│ │
↓ ↓
binding pocket protein interface
│ │
↓ ↓
PyRosetta PyRosetta
│ │
↓ ↓
MD MD

所以：

Vina解决的是“小分子怎么结合蛋白”，ZDOCK解决的是“两个蛋白怎么结合”。

二十四、如果你准备真正跑一次ZDOCK

建议不要一开始就拿自己的课题蛋白。

可以先做这个练习：

练习项目

PD-1 + PD-L1

完整跑：

1. 下载PDB
↓
2. 拆分两个蛋白
↓
3. 清理PDB
↓
4. ZDOCK
↓
5. 得到2000 poses
↓
6. Clustering
↓
7. 选Top 10
↓
8. PyMOL观察
↓
9. Interface分析
↓
10. 与实验PDB比较
↓
11. 计算RMSD
↓
12. 判断ZDOCK是否成功预测

其中最后一步特别关键：

假设实验结构是：

Experimental complex