丹参染色体水平基因组--文献精读234

Chromosome-level genome assembly of Salvia miltiorrhiza with orange roots uncovers the role of Sm2OGD3 in catalyzing 15,16-dehydrogenation of tanshinones

橙根丹参染色体水平基因组组装揭示 Sm2OGD3 催化丹参酮 15,16 – 位脱氢的功能

摘要

丹参是治疗心脑血管疾病的常用传统中药材。其根部因大量积累丹参酮 ⅡA、丹参酮 Ⅰ 等红色色素，通常呈现砖红色。本研究鉴定得到一份橙根丹参株系（shh）。与普通红根丹参相比，该株系根部中C15、C16 位为单键的丹参酮含量显著上升，而C15、C16 位为双键的丹参酮含量明显下降。

本研究完成了橙根丹参 shh 的高质量染色体水平基因组组装。系统发育基因组分析显示，两份红根丹参材料的亲缘关系更近，表明 shh 并非现有红根丹参株系突变而来。结合比较基因组与转录组分析发现，shh 的Sm2OGD3基因发生了一段 1.0 kb 片段缺失。基因回补实验证实，在 shh 毛状根中过表达完整Sm2OGD3，可恢复呋喃 D 环型丹参酮的积累。

体外酶活实验进一步表明，Sm2OGD3 可分别催化隐丹参酮、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ，生成丹参酮 ⅡA、丹参酮 Ⅰ 与 1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ。综上，Sm2OGD3 是丹参酮 15,16 – 脱氢酶，为丹参酮生物合成的关键酶。本研究结果为解析药用活性成分丹参酮的代谢网络提供了新依据。

引言

丹参是我国经典中药材，也是药用植物生物学研究的模式物种 [1]，临床上广泛用于心脑血管疾病的治疗，同时对肿瘤、神经退行性疾病等也具有一定防治作用 [2,3]。丹参根部合成的脂溶性丹参酮是其主要活性成分 [4,5]。

隐丹参酮、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ、亚甲基二氢丹参醌等化合物的 C15、C16 位为单键；而丹参酮 Ⅰ、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ、丹参酮 ⅡA、丹参酮 ⅡB、亚甲基丹参醌的 C15、C16 位则为双键 [6,7]。

丹参酮的生物合成大致分为四个阶段：首先合成五碳异戊二烯单元 —— 异戊烯焦磷酸及其异构体二甲基烯丙基焦磷酸；其次生成中间体牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸；接着合成萜类母核柯巴基焦磷酸与迷迭香二烯；最后经多步修饰生成各类丹参酮组分 [1]。目前，前三个合成阶段及相关催化酶基因已基本阐明 [8-12]，但第四阶段涉及羟基化、氧化、杂环化、脱氢、去甲基化等多种修饰反应，过程复杂，相关分子机制仍有待解析。

现有研究证实，CYP76、CYP71 亚家族的细胞色素 P450（CYP450）参与丹参酮合成。SmCYP76AH1 催化迷迭香二烯羟基化生成铁锈醇；SmCYP76AH3 可进一步将铁锈醇转化为 11 – 羟基铁锈醇、柳杉酚与 11 – 羟基柳杉酚 [13,14]。11 – 羟基铁锈醇和 11 – 羟基柳杉酚会在 SmCYP76AK1 作用下发生 C20 位羟基化；SmCYP71D411 则催化柳杉酚生成 20 – 羟基柳杉酚 [14,15]。此外，SmCYP71D375 可催化迷迭香酮、4 – 亚甲基迷迭香酮及 Ro 组分发生羟基化与杂环化，形成 C15、C16 位为单键的 D 环结构，该步反应也可由 SmCYP71D373 催化完成 [15]。

除 CYP450 外，2 – 氧代戊二酸依赖型双加氧酶（2OGD）超家族也被证实参与丹参酮生物合成 [16-18]。2OGD 是一类定位于细胞质的非血红素铁氧化酶，也是自然界功能最多样的氧化酶之一 [19]。该家族蛋白含有保守的2 – 组氨酸 – 1 – 羧酸三联体（HX (D/E) X50–210H）与 RXS 基序，以二价铁离子为活性中心辅因子，2 – 氧代戊二酸和分子氧为辅底物，催化各类有机底物发生氧化反应 [20]。其催化的反应类型包括羟基化、脱烷基、去甲基、脱氢、环氧化、差向异构、环化、卤化、过氧化物生成以及环的扩环 / 缩环等 [19-23]。

目前研究较为深入的 2OGD 主要包括参与赤霉素代谢的赤霉素 20 – 氧化酶、赤霉素 2 – 氧化酶、赤霉素 3 – 氧化酶，以及参与黄酮代谢的黄酮合酶 Ⅰ、黄烷酮 3β- 羟化酶、黄酮醇合酶、无色花色素合酶等 [22,23]。相较于 CYP450，丹参中 2OGD 的研究仍相对薄弱，但这类基因普遍被认为是丹参酮合成的重要候选基因 [16,24]。丹参基因组共注释到 132 个Sm2OGD家族基因 [16]。已有报道显示，下调Sm2OGD5表达会显著降低转基因丹参毛状根中迷迭香酮、隐丹参酮和丹参酮 ⅡA 的含量，但该蛋白的催化功能尚不明确 [16]。另有研究表明，Sm2OGD25 可催化柳杉酚羟基化，生成海帕根素 B 与交格素 C [17]；Sm2OGD14 能够分别催化隐丹参酮、异隐丹参酮生成丹参酮 ⅡA、异丹参酮 ⅡA [18]。

丹参的根与根茎是传统药用部位，因周皮大量积累丹参酮 ⅡA、丹参酮 Ⅰ 等红色脂溶性成分，外观呈红色，故得名 “丹参”[4,5,25,26]。本研究以橙根丹参株系 shh 为材料，发现其根部 C15、C16 位单键型丹参酮含量升高，双键型不饱和丹参酮含量显著降低。为解析该表型背后的物质代谢差异，本研究完成了 shh 的染色体水平全基因组测序与组装。结合比较基因组、转录组分析发现，该株系Sm2OGD3基因存在片段缺失突变。体外酶活与转基因毛状根回补实验证实，Sm2OGD3 负责催化丹参酮 C15、C16 位脱氢。上述结果表明，Sm2OGD3片段缺失是橙根丹参 shh 中 15,16 – 位不饱和丹参酮含量下降的主要原因。

结果

橙根（shh）与红根（99–3）丹参株系的丹参酮代谢组对比及超高效液相色谱分析

丹参酮主要富集于丹参根的周皮组织中 [4,5]，多数丹参酮类化合物呈现出从橙色至红色的不同色泽 [25,26]。例如，丹参酮 ⅡA、丹参酮 Ⅰ、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ 的甲醇溶液为红色，而隐丹参酮、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ 的甲醇溶液则呈橙色（图 1d）。

普通丹参株系（如 99–3）的根系因大量积累丹参酮 ⅡA、丹参酮 Ⅰ、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ 等红色丹参酮，整体表现为砖红色（图 1b）。本研究发现一份天然丹参株系，其根系为橙色（图 1a）。该株系于 1999 年在我国陕西省首次发现，后移栽至中国医学科学院药用植物研究所试验苗圃，通过根插方式繁育至今已有约 20 年，将其命名为山黄（shh）。

图 1 丹参株系 shh 与 99–3 中丹参酮的超高效液相色谱分析

橙根株系 shh (a) 与红根株系 99–3 (b) 的根系表型差异；(c) 99–3 和 shh 成熟根系的超高效液相色谱检测图谱；(d) 各类丹参酮单体的显色特征。其中隐丹参酮、丹参酮 ⅡA 浓度均为 2 mg/mL，15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、丹参酮 Ⅰ 浓度为 0.5 mg/mL，1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ 浓度为 1 mg/mL；(e) shh 与 99–3 成熟根系中各丹参酮组分的含量。误差线代表标准误。缩写说明：CT = 隐丹参酮；TAII = 丹参酮 ⅡA；15,16-DHT=15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ；TAI = 丹参酮 Ⅰ；THT=1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ；1,2-DHT=1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ。

为解析 shh 株系的化学成分变化，本研究对 99–3 与 shh 的根系样本开展代谢组对比分析。采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA） 筛选差异代谢物，筛选标准：变量重要性投影值（VIP）＞1.0、P＜0.05、差异倍数＞1.5 或 ＜0.67。共鉴定出 29 个含量存在显著差异的代谢物，其中丹参酮 ⅡA、隐丹参酮、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ、丹参酮 Ⅰ 为 VIP 值排名前四的组分（附表 S1）。C15、C16 位含双键的丹参酮 ⅡA、丹参酮 Ⅰ、丹参酮甲酯，含量分别下调至原来的 1/17.78、1/46.24、1/39.06；而 C15、C16 位为单键的丹参酮类物质，包括 1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ、隐丹参酮、甲基隐丹参酮、隐丹参酮酸酐，含量分别上调 2.24 倍、1.76 倍、3.87 倍、19.76 倍。此外，丹参酮合成通路上游产物柳杉酚、迷迭香酮 Ⅰ、脱氢迷迭香酮的含量也分别提升 2.00 倍、1.94 倍、2.56 倍。

利用超高效液相色谱（UPLC）进一步验证两株系间丹参酮积累的显著差异（图 1c）。红根株系 99–3 中，C15、C16 位双键型的丹参酮 ⅡA、丹参酮 Ⅰ、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ 含量依次为 1.42 mg/g、0.11 mg/g、0.79 mg/g（鲜重），而这三类物质在 shh 根系中几乎检测不到（图 1e）。与之相反，shh 根系中 C15、C16 位单键型的隐丹参酮、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ 含量，分别为 99–3 株系的 2.36 倍、1.23 倍、1.52 倍（图 1e）。综合以上结果可推断：shh 株系体内丹参酮的 15,16 – 位脱氢过程受到抑制。

橙根丹参株系 shh 的染色体水平基因组组装

目前已有四份红根丹参的全基因组组装数据发表 [15,27-29]，但尚无橙根丹参的基因组序列。为挖掘调控 shh 丹参酮合成差异的关键基因，本研究完成了该橙根株系染色体水平全基因组组装（图 2a）。

基于 28.73 Gb 二代 Illumina 短读长数据开展 17-mer 分析，预估 shh 基因组大小为 581.68 Mb，基因组杂合度为 1.34%（附表 S2）。本研究整合多种测序技术开展基因组测序（附表 S3），最终获得 64.90 Gb PacBio 长读长数据、66.57 Gb Illumina 二代数据以及 124.14 Gb 10×Genomics 条码测序数据。

初步组装得到基因组总长 530.97 Mb，支架 N50 为 2.01 Mb，重叠群 N50 为 1.05 Mb，覆盖预估基因组大小的 91.28%。其重叠群 N50 长度，是以往丹参基因组组装版本的 2~83 倍（表 2）。

进一步利用 133.51 Gb Hi-C 数据辅助染色体挂载 [30]，最终将 371 个支架（总长 496.5 Mb，占组装基因组的 93.51%）锚定至 8 条假染色体（附图 S1、S2）。经 Hi-C 优化后，超级支架 N50 达到 60.28 Mb，最长支架长度为 77.73 Mb（表 1、附表 S4）。

图 2 丹参株系 shh 的基因组特征、同义替换率分布及系统发育基因组分析

(a) shh 基因组组装全景图。最外层空心区块代表 8 条假染色体；第 2 至第 5 圈依次为基因密度、shh 幼根与成熟根间差异表达基因密度、长末端重复序列、转座元件分布；第 6、7 圈分别为 GC 含量及共线性区块分布。(b) 沟酸浆、红根丹参、橙根丹参 shh、一串红、葡萄的旁系同源基因同义替换率（Ks）分布，以及 shh 分别与一串红、沟酸浆共线性区块中同源基因对的Ks分布。(c) shh 与其他 13 个物种的系统发育树，包含：3 份丹参材料（99–3、未知品系丹参）、一串红、沟酸浆、芝麻、狸藻、油橄榄、番茄、马铃薯、人参、胡萝卜、拟南芥、毛果杨。

利用 BWA 软件将二代 Illumina 短读长序列比对至组装基因组，以此评估组装完整性与测序均一性 [31]。结果显示，序列比对率达 95.96%，基因组覆盖率 99.74%，平均测序深度为 46.77%。进一步采用 BUSCO、CEGMA 开展评估 [32,33]，分别鉴定出 88% 的单拷贝直系同源基因、89.52% 的真核生物核心保守基因（附表 S5）。以上结果表明，橙根丹参 shh 的染色体水平基因组组装具备高连续性与高完整性。

结合同源比对与从头预测两种方法，对基因组重复序列进行鉴定（附表 S6、S7）。结果显示，shh 基因组中重复序列占比约 56.65%（图 2a）；其中长末端重复序列（LTR） 为最主要的转座元件，占全基因组的 49.30%。

综合从头预测、同源预测、转录组辅助预测三种策略，共注释得到 32191 个蛋白编码基因，编码区（CDS）平均长度为 1191 bp（表 1、附表 S8）。基因总数与已发表的丹参基因组数据相近（表 2）。在全部蛋白编码基因中，30538 个基因（占 94.9%）完成功能注释，注释数据库包括瑞士蛋白库、非冗余蛋白库、京都基因与基因组百科全书、蛋白结构域数据库、基因本体论、蛋白家族数据库等（附表 S9）。

系统发育基因组分析解析橙根株系 shh 的演化地位

获得完整基因组后，本研究进一步探究 shh 的演化起源。将 shh 基因组与其他植物基因组开展比对，比对材料包括：6 种鼠尾草属植物（丹参 99–3、未知品系丹参、丹参 DSS3、南丹参、西班牙鼠尾草、一串红）、7 种唇形目植物（沟酸浆、芝麻、狸藻、油橄榄、黄芩）、2 种茄科植物（番茄、马铃薯）、2 种伞形目植物（人参、胡萝卜），以及拟南芥、毛果杨。基于单拷贝基因家族，采用最大似然法构建系统发育树。

系统发育树结果显示，3 份丹参株系与一串红聚为一支；丹参与一串红的共同祖先大约在3630 万年前（MYA） 发生分化（图 2c）。值得注意的是，两份红根丹参株系亲缘关系很近，分化时间约为 1620 万年前；而橙根株系 shh 与红根丹参的共同祖先分化时间则约为 1860 万年前（图 2c）。

本研究进一步将丹参 DSS3、南丹参、西班牙鼠尾草、黄芩纳入分析并构建新的系统发育树，结果显示南丹参与多份丹参株系聚群，且和红根丹参 99–3 的亲缘关系最近（附图 S3）。南丹参与丹参 99–3 的分化时间约为 1040 万年前（附图 S4）。已有研究表明，在唇形科演化支中，南丹参与丹参的分化时间约为 394 万年前 [34]，说明二者在分子水平上相似度极高，且南丹参根部在实际应用中可作为丹参的替代品 [34]。shh 与丹参 99–3、南丹参的共同祖先分化时间约为 1380 万年前（附图 S4）。

橙根株系 shh 与各红根丹参、南丹参聚类在一起，证明 shh 并非现有红根丹参株系的突变体。据此推测，shh、红根丹参与南丹参的共同祖先应为红根类型物种。

本研究继而探究：橙根丹参是否发生了物种特异性全基因组复制（WGD），并由此导致丹参酮积累模式改变。为此，我们对旁系同源基因及共线性区块开展同义替换率（Ks） 分布分析。结果表明，一串红在与丹参分化后，先后发生了两次物种特异性全基因组复制事件；而 shh 未检测到近期全基因组复制事件，各红根丹参株系同样无近期全基因组复制发生（图 2b）。这说明无近期全基因组复制是丹参物种的共有特征，shh 体内丹参酮含量变化并非由全基因组复制导致。

橙根（shh）与红根（99–3）丹参中丹参酮合成相关已知基因的转录组比较分析

丹参酮属于脂溶性二萜类天然产物，经由萜类生物合成途径生成。目前已在红根丹参中鉴定出 19 个参与丹参酮合成的酶编码基因家族 [1]。为明确这类基因在 shh 中的特征，本研究在 shh 基因组中，对上述已报道的功能基因进行全基因组同源基因鉴定 [8,9,11-13,15]，结果在 shh 基因组中均能找到对应的同源基因（附表 S10）。

转录组差异分析显示，在成熟根周皮组织中，这类基因在 shh 与 99–3 中的表达水平无显著差异（图 3）。上述结果表明，shh 丹参酮积累的改变，并非由已知合成酶基因功能缺失或表达量大幅变化引起。

图 3 shh 与 99–3 成熟根周皮中丹参酮合成相关已知基因的转录组分析

每份株系设置 3 个生物学重复；表达量采用经ZeroToOne 标准化后取对数的TPM值展示。

比较基因组与转录组联合分析证实：橙根株系 shh 的Sm2OGD3发生片段缺失突变

为进一步解析 shh 丹参酮组分改变的分子机制，本研究利用 99–3 与 shh 成熟根周皮的转录组数据开展差异分析 [24]。以校正后P值（padj）＜0.05 为筛选阈值，共鉴定得到 3416 个差异表达基因（DEG）（附图 S5），其中 2162 个基因在 shh 中表达下调，包含 12 个Sm2OGD家族基因（图 4a）。

2 – 氧代戊二酸依赖型双加氧酶（2OGD）是一大类氧化酶，近年研究证实丹参 2OGD 家族成员参与丹参酮的生物合成 [16-18,24]。为筛选催化生成 C15、C16 位双键型丹参酮的候选Sm2OGD基因，本研究设定三项筛选标准：① 相较于 99–3，基因在 shh 根周皮中显著下调；② 在 99–3 根周皮中高表达；③ 在花、茎、叶、根等不同组织中，特异性在 99–3 根系高表达。

聚类热图结果显示，12 个下调的Sm2OGD基因中，SMil_00016113、SMil_00018668、SMil_00020342 与丹参酮合成通路关键基因（SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1、SmCYP71D411、SmCYP71D373、SmCYP71D375）存在共表达关系（图 4a、附图 S6）。

结合已有研究 [16] 分析发现，SMil_00020342 在 99–3 茎中的表达量远高于根系（附图 S7），说明该基因与丹参酮合成无关。因此，最终选取SMil_00016113与SMil_00018668开展后续研究。

图 4 丹参Sm2OGD3基因的基因组与转录组分析

(a) 热图展示 12 个差异表达Sm2OGD基因在 shh 与 99–3 成熟根周皮中的表达水平。聚类分析结果显示，SMil_00016113、SMil_00018668、SMil_00020342的表达模式，与已知参与丹参酮合成的SmCYP76AH1、SmCYP76AH3、SmCYP76AK1、SmCYP71D411、SmCYP71D373、SmCYP71D375高度相似。(b) 丹参 bh2–7、DSS3、99–3 与 shh 株系中Sm2OGD3基因的序列比对分析。Sm2OGD3基因包含3 个外显子（实心方框）和2 个内含子（带黑框白色方框）；99–3 基因组注释得到的两个基因模型 SMil_00018668、SMil_00016113，分别以橙框、绿框白色方框标示。图中标注了 Sm2OGD3 蛋白的两个保守结构域：DIOX_N 与 2OG-FeII_Oxy。红色虚线表示突变基因Sm2OGD3m缺失一段 1.0 kb 片段，该片段包含完整的第二个外显子，以及部分第一段、第二段内含子序列；红色星号代表第一个提前终止密码子。

已有研究将SMil_00018668命名为Sm2OGD3[16]。利用 NCBI 非冗余蛋白数据库开展 ** 蛋白序列比对（BLASTp）** 发现，SMil_00016113 与 SMil_00018668 编码的均为不完整蛋白：仅含 DIOX_N 结构域的 SMil_00016113，对应 2OGD 基因的 5' 端区域；含 2OG-FeII_Oxy 结构域的 SMil_00018668，则对应基因的 3' 端区域（图 4b）。

为明确二者来源，本研究将两条序列分别与 3 份红根丹参（99–3 [28]、bh2–7 [15]、DSS3 [29]）的基因组序列进行核酸序列比对（BLASTn）。结果显示，在 bh2–7 与 DSS3 基因组中，两个序列均定位至同一个含 3 个外显子的Sm2OGD基因：其中 SMil_00016113 对应第一个外显子，SMil_00018668 对应第二、第三个外显子（图 4b）。

将序列比对至 99–3 基因组时发现，SMil_00016113 位于 5164 号支架，SMil_00018668 位于 2881 号支架。由于 99–3 基因组组装质量相对偏低，推测两个序列存在组装错位。为验证二者在 99–3 中是否源自同一个Sm2OGD基因，本研究设计特异性引物（附表 S11），分别以 99–3 根系 ** 基因组 DNA（gDNA）和互补 DNA（cDNA）** 为模板进行 PCR 扩增。实验证实，SMil_00016113 与 SMil_00018668 确实属于 99–3 中的同一个Sm2OGD基因（图 4b）。

基于上述结果，本研究校正得到 99–3 中Sm2OGD3的全长基因组序列与编码区序列（附表 S12）。校正后的编码区序列开放阅读框全长 1119 个核苷酸，编码 373 个氨基酸。

将 SMil_00016113 与 SMil_00018668 比对至 shh 基因组，仅匹配到一段 1.2 kb 的基因组序列：该序列 5' 端对应 SMil_00016113，3' 端对应 SMil_00018668 的 3' 区，但缺失了 SMil_00018668 的 5' 端序列（图 4b）。与 99–3 正常Sm2OGD3相比，shh 的这段序列缺失约 1.0 kb 片段，对应完整第二个外显子，以及部分第一、第二个内含子。本研究将 shh 中的该突变基因命名为Sm2OGD3m。

使用同一组引物，以 shh 根系基因组 DNA 和 cDNA 为模板再次开展 PCR 扩增，并结合Sm2OGD3m全长基因组序列与编码区序列（附表 S12）分析发现：片段缺失破坏了原有剪接位点，使Sm2OGD3m发生外显子跳跃型可变剪接，编码区仅保留第一、第三个外显子；同时阅读框偏移，导致翻译提前终止。其第一个终止密码子出现在第 541–543 位核苷酸，最终仅编码 180 个氨基酸的截短蛋白，蛋白中关键的2 – 组氨酸 – 1 – 羧酸三联体保守基序与 RXS 保守基序完全丢失 [20]。

Sm2OGD3 重组蛋白可催化丹参酮 15,16 – 位脱氢

为验证 Sm2OGD3 是否具备催化丹参酮 15,16 – 位脱氢的功能，本研究从 99–3 根系中扩增获得Sm2OGD3全长 cDNA，并将其连接至大肠杆菌表达载体pET-30a（附图 S8a）。随后在大肠杆菌 BL21 (DE3) 菌株中诱导表达，获得 Sm2OGD3 重组蛋白（附图 S8b）。

开展体外酶活实验，以转入空 pET-30a 载体的大肠杆菌作为阴性对照。将粗酶液分别与 C15、C16 位为单键的隐丹参酮（CT）、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ（THT）、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ（15,16-DHT）共孵育，利用乙酸乙酯萃取反应产物，再通过 ** 液相色谱 – 质谱联用（LC-MS）** 检测，并将二级质谱（MS-MS）图谱与标准品比对。

结果显示：隐丹参酮、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ 可分别被催化转化为丹参酮 ⅡA、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ、丹参酮 Ⅰ（图 5）；而转入空载体的对照组未检测到上述转化反应（图 5）。证实Sm2OGD3 重组蛋白可将丹参酮 C15、C16 位的单键催化生成双键。

图 5 Sm2OGD3 重组蛋白的体外酶活检测

(a) 分别以隐丹参酮、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ 为底物，采用超高效液相色谱分析 Sm2OGD3 催化的反应产物；以转入空 pET-30a 载体的大肠杆菌粗酶液作为对照组（CK）。反应辅因子为 160 μM 2 – 氧代戊二酸与 50 μM 硫酸亚铁。(b~g) 反应产物与标准品的二级质谱图比对。依次为标准品丹参酮 ⅡA (b)、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ(d)、丹参酮 Ⅰ(f) 的质谱图；以及反应产物质谱图：Sm2OGD3 + 隐丹参酮（保留时间 21.69 min，c）、Sm2OGD3+1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ（保留时间 17.78 min，e）、Sm2OGD3+15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ（保留时间 15.46 min，g）。每张图谱右上角标注响应值与准分子离子分子量，同时附丹参酮 ⅡA、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ、丹参酮 Ⅰ 的化学结构式。

缩写说明：CT = 隐丹参酮；TAII = 丹参酮 ⅡA；15,16-DHT=15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ；TAI = 丹参酮 Ⅰ；THT=1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ；1,2-DHT=1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ

本研究以 15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ 为底物，进一步探究反应体系各组分对酶活性的影响（附图 S9）。结果显示：反应体系中抗坏血酸缺失时，单纯提高 2 – 氧代戊二酸与二价铁离子浓度，无法显著提升反应速率（实验组 1、2、6、7）；仅去除二价铁离子，与仅去除抗坏血酸的反应速率相近（实验组 3）；体系同时含有二价铁离子与抗坏血酸时，反应速率显著上升（实验组 4、5）。

以隐丹参酮为底物，设置不同温度（20℃、30℃、37℃）与 pH 值（5.8、6.5、7.3、8.0）筛选最优反应条件，确定最适温度为 30℃，最适 pH 为 8.0（附图 S10）。

采用最优条件与实验组 5 的反应体系，测定不同底物浓度下的酶促反应速率。测得 Sm2OGD3 针对隐丹参酮、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ 的米氏常数 (\\(K_m\\)) 分别为 32.15 μM、55.42 μM、20.92 μM，最大反应速率 (\\(V_{max}\\)) 依次为 0.3318 μM/min、1.228 μM/min、0.7303 μM/min（附图 S11）。结果表明，该酶对 1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ 的底物亲和力最高，其次为隐丹参酮。

结合丹参植株根系物质含量分析：天然根系中隐丹参酮含量高于 1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ，产物丹参酮 ⅡA 含量也高于 1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ（图 1c），底物与对应产物的积累水平整体相近。这说明 Sm2OGD3 的催化转化效率，很大程度上依赖于底物浓度。

完整 Sm2OGD3 可恢复橙根株系 shh 转基因毛状根中 C15、C16 位双键型丹参酮的合成

本研究利用携带Sm2OGD3完整开放阅读框重组载体的发根农杆菌 ACCC10060侵染橙根丹参 shh，获得转基因毛状根；以不含目的基因的 ACCC10060 菌株处理组作为空白对照。

超高效液相色谱检测结果显示：未转入完整Sm2OGD3的 shh 毛状根中，检测不到丹参酮 Ⅰ、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ、丹参酮 ⅡA，与 shh 植株根系的物质特征一致（图 1）。

在转入完整Sm2OGD3的转基因毛状根中（图 6a~d），C15、C16 位双键型丹参酮恢复积累（图 6e）。其中 4 号、5 号、8 号株系的丹参酮 Ⅰ、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ、丹参酮 ⅡA 平均含量分别为 0.045 mg/g、0.024 mg/g、0.037 mg/g（鲜重）。

与此同时，根系内 C15、C16 位单键型丹参酮含量显著下降：隐丹参酮、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ 的含量，分别降至对照组的 1/1.28、1/5.25、1/1.52（图 6f）。

图 6 丹参转基因毛状根的超高效液相色谱分析

(a~d) 转基因毛状根生长状态：(a) 转基因毛状根在含 50 mg/L 潮霉素的筛选培养基上生长一周，潮霉素抗性植株长势正常；(b) 液体培养基中培养的转基因毛状根；(c) 8 号转基因株系成熟毛状根；(d) 对照组（shh）成熟毛状根。(e) 4 号转基因株系与对照组成熟毛状根的超高效液相色谱比对结果。(f) 转基因毛状根与对照组中隐丹参酮、丹参酮 ⅡA、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、丹参酮 Ⅰ、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ 的含量对比。误差线代表标准误；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，ns 表示差异不显著。

鼠尾草属植物中Sm2OGD3的同源基因

本研究开展期间，另有报道鉴定出Sm2-ODD14，该基因被命名为丹参酮 ⅡA 合酶（SmTIIAS），其编码蛋白可分别催化隐丹参酮、异隐丹参酮生成丹参酮 ⅡA、异丹参酮 ⅡA（图 7）[18]。序列比对显示，SmTIIAS与Sm2OGD3开放阅读框序列一致性达 98.6%，氨基酸序列一致性为 97.3%。二者均能催化隐丹参酮转化为丹参酮 ⅡA，但底物谱存在差异：SmTIIAS底物特异性极强，仅识别隐丹参酮与异隐丹参酮；而Sm2OGD3底物范围更广，可利用隐丹参酮、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ 作为反应底物。

为厘清两个基因的关系，本研究在 2 份丹参株系（99–3、DSS3）及多个已有基因组数据的鼠尾草属物种（南丹参、一串红、药用鼠尾草）中，分别鉴定这两个基因。结果发现，在以上 5 种鼠尾草属植物中，Sm2OGD3与SmTIIAS的基因组定位完全一致（附表 S13）。这表明丹参中并非同时存在这两个独立基因，二者实为不同丹参株系中的等位基因。

为进一步验证各等位基因及同源基因的催化功能，本研究人工合成SmTIIAS及新鉴定的同源基因序列（附表 S12、附图 S12）。体外酶活实验结果表明：与Sm2OGD3一致，SmTIIAS、丹参 DSS3 的Sm2OGD3_DSS3、南丹参的Sb2OGD3均可催化隐丹参酮、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ，分别生成丹参酮 ⅡA、丹参酮 Ⅰ、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ（附图 S13）。而一串红的Ss2OGD3_like与药用鼠尾草的So2OGD3_like无法催化该步 15,16 – 位脱氢反应（附图 S13）。

该结果与物种代谢表型相符：南丹参根部丹参酮含量较高，可作为丹参的药用替代品 [34]；而药用鼠尾草与一串红体内的隐丹参酮、丹参酮 ⅡA、丹参酮 Ⅰ 含量极低，甚至无法检出 [35,36]。

讨论

丹参兼具较高经济价值与药用价值，现已成为药用植物生物学研究的模式物种，受到学界广泛关注 [1]。目前已积累大量丹参不同组织、不同处理条件下的转录组与小 RNA 组数据，同时 4 份红根丹参株系的全基因组也已完成测序与组装 [1,15,27-29]。

本研究结合二代双端测序、10X Genomics、PacBio 长读长测序等多种技术，完成了新型橙根丹参株系 shh 的染色体水平基因组组装。该基因组总长 530.97 Mb，其中 93.51% 的序列锚定至 8 条假染色体；超级支架 N50 达 60.28 Mb，最长支架长度为 77.73 Mb，组装连续性与完整性优异，为解析丹参活性成分合成的功能基因组学研究奠定了重要基础。

由于 99–3 基因组组装质量欠佳，本研究选用组装至染色体水平的丹参 DSS3 基因组，利用 MCScanX 软件基于蛋白序列比对开展共线性分析。结果显示，shh 与 DSS3 基因组的编码基因在全基因组范围内共线性程度较高（附图 S14）。DSS3 的Sm2OGD3_DSS3（编号：GWHGAOSJ020467）定位于 7 号假染色体，无对应共线性片段；shh 的Sm2OGD3m位于 7 号假染色体（位置：311089–309911）。此外，DSS3 3 号、5 号假染色体上的部分片段，在 shh 假染色体中未找到对应共线性区块（附图 S14）。若要系统解析基因组结构变异，还需开展全基因组序列比对，并结合 DSS3 与 shh 的二代、三代测序数据，利用更完善的生物信息学方法深入分析。

与常规砖红色根系丹参不同，shh 株系根系呈橙色。代谢组与超高效液相色谱检测证实，该株系体内 C15、C16 位为单键的丹参酮含量上升，双键型丹参酮含量显著下降，这一物质积累特征与另一橙根丹参株系报道一致 [25]。

已有转录组研究显示，橙根丹参中 4 个内质网相关蛋白降解通路基因表达上调，而细胞色素 P450、烟酰胺辅酶依赖型脱氢酶与还原酶相关基因无明显下调 [25]。据此推测，催化 15,16 – 位脱氢的酶发生折叠异常，并经由内质网相关降解途径被降解，最终导致呋喃 D 环型丹参酮含量降低 [25]。

本研究明确 Sm2OGD3 是催化丹参酮 15,16 – 位脱氢的关键酶；shh 中的Sm2OGD3因缺失第二个外显子，翻译产生截短蛋白Sm2OGD3m。由此证实，shh 体内单键型丹参酮积累、双键型丹参酮减少，主要由 Sm2OGD3 功能丧失所致。

参照前人研究 [25]，本研究在丹参 99–3 中鉴定出内质网相关降解通路基因（除c91931_g1外，附表 S14）。其中SMil_00017121在 shh 中显著上调，对数倍变化值为 2.6，校正后P值为 0.0015；SMil_00006173与SMil_00005538在两株系根周皮中无显著表达差异。基因c80749_g2注释为内质网腔结合蛋白（BIP）[25]；SMil_00017121经数据库注释，属于热休克蛋白 HSP70 家族的内质网腔结合蛋白。

以上结果提示，shh 中截短型 Sm2OGD3 蛋白发生折叠错误，进而触发内质网相关蛋白降解过程。本研究证实橙根株系 shh 的Sm2OGD3存在突变，而其他橙根丹参株系是否携带相同突变，仍有待进一步验证。本成果也为解析丹参橙根表型的形成机制提供了重要理论依据。

图 7 推测的丹参酮生物合成通路

实线箭头代表已验证的催化反应，虚线箭头代表推测的反应。

植物 2OGD 超家族分类与功能分析

植物 2 – 氧代戊二酸依赖型双加氧酶（2OGD）超家族主要分为DOXA、DOXB、DOXC三大类 [23]。其中 DOXA 与 DOXB 家族成员主要参与 DNA 修复、组蛋白去甲基化、蛋白质翻译后修饰等初级代谢过程 [23]；DOXC 家族除参与植物激素保守代谢通路外，还负责合成酚酸、生物碱等特化次生代谢产物 [21]。

丹参株系 99–3 基因组共注释到 132 个Sm2OGD基因，包括 3 个 DOXA 类、8 个 DOXB 类、118 个 DOXC 类，另有 3 个暂未分类 [16]。118 个 DOXC 家族成员可进一步划分为 13 个进化分支，分别为 ACO、AOP、CODM/NCS、D4H/GSLOH/BX6、DAO、F3H、FLS/ANS、GA2ox、GA3ox、GA20ox、H6H、S3H 及未知分支 [16]。本研究中的Sm2OGD3归属于D4H/GSLOH/BX6分支。

shh 株系中 12 个显著下调的Sm2OGD基因，分属 DOXC 家族的 6 个不同分支。本研究结合基因组与转录组比对、体外酶活、体内回补实验证实，Sm2OGD3 是催化丹参酮发生 15,16 – 位脱氢的关键酶。来自其他丹参株系及南丹参的 Sm2OGD3 同源蛋白，同样可催化隐丹参酮、15,16 – 二氢丹参酮 Ⅰ、1,2,15,16 – 四氢丹参酮 Ⅰ，分别生成丹参酮 ⅡA、丹参酮 Ⅰ、1,2 – 二氢丹参酮 Ⅰ。

上述结果明确了 Sm2OGD3 在丹参酮合成关键步骤 ——15,16 – 位脱氢反应中的催化功能（图 7）。该酶的鉴定，对解析丹参酮合成通路与调控机制具有重要意义，也为这类高药用、经济价值活性成分的合成生物学研究提供了基础。

材料与方法

文库构建与测序

参照试剂盒说明书，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法提取 shh 叶片基因组 DNA（gDNA）[37]。

基因组组装与质量评估

使用 FALCON 软件基于 PacBio 长读长完成初步重叠群组装，再通过 FALCON-Unzip 进行分型；借助 Quiver 软件利用 PacBio 数据对重叠群进行校正 [38]，随后使用 Pilon 软件结合 Illumina 数据进一步提升组装质量 [39]。

由于丹参基因组杂合度较高，采用purge_haplotigs软件去除冗余单倍型序列 [40]；再利用 fragScaff 软件结合 10× Genomics Linked-reads 数据完成支架搭建 [41]。

将 Illumina 短读长序列比对至组装基因组，统计比对率、基因组覆盖率与测序深度，评估组装完整性与测序均一性；同时采用 CEGMA [33] 和 BUSCO [32] 软件评估基因组组装完整度。

Hi-C 文库构建与染色体挂载

Hi-C 文库构建

使用多聚甲醛对基因组 DNA 进行交联固定，再经酶切、生物素标记末端；利用 T4 DNA 连接酶使邻近染色质 DNA 片段发生连接，随后加入蛋白酶解除蛋白交联并纯化基因组 DNA。将 DNA 随机打断至 350 bp 左右，通过亲和磁珠富集带生物素标记的片段，依次完成末端修复、加 A 尾、接头连接、PCR 扩增与模板纯化，最终构建完成 Hi-C 文库，采用 Illumina HiSeq PE150 平台测序。

染色体挂载

将过滤后的 Hi-C 测序读段比对至基因组草图，利用 SAMtools 软件rmdup参数去除重复序列与未比对读段 [42]，筛选含连接位点的有效读段用于辅助组装。使用 LACHESIS 软件（版本 201701）完成重叠群的染色体定位、排序与方向校正。

基因组注释

本研究结合同源比对与从头预测两种方法完成重复序列注释 [43]。利用 RepeatMasker 软件（官网：http://www.repeatmasker.org/），将基因组序列与重复序列数据库 Repbase 比对，实现同源类重复序列注释；使用串联重复序列识别工具 TRF（官网：http://tandem.bu.edu/trf/trf.html）提取基因组中的串联重复序列。

通过 LTR_FINDER [44]、RepeatScout、RepeatModeler 开展从头预测，构建物种特异性重复序列数据库。筛选长度大于 100 bp、空缺碱基（N）占比低于 5% 的序列，构建原始转座元件文库；再借助 UCLUST 软件 [45] 合并 Repbase 与自建转座元件文库，得到非冗余重复序列库，最终利用该文库结合 RepeatMasker 完成全基因组重复序列鉴定。

采用同源预测、从头预测、转录组辅助预测联合策略进行基因结构注释。同源预测部分：下载拟南芥、番茄、人参、芝麻、一串红及丹参 99–3 的蛋白序列，通过 TblastN（v2.2.26，阈值\\(E\\text{-value} \\le 10^{-5}\\)）[46] 与 shh 基因组比对；再利用 GeneWise（v2.4.1）[47] 根据匹配蛋白序列预测基因剪接位点。

从头预测使用 Augustus（v3.2.3）、Geneid [48]、Genescan [49]、GlimmerHMM [50]、SNAP [51] 多款软件。转录组辅助注释：使用 TopHat [52] 将不同组织的转录组读段比对至 shh 基因组，比对结果导入 Cufflinks [53] 进行转录本组装。利用 EvidenceModeler [54] 整合三种预测结果，得到非冗余基因集；最后通过 PASA 软件进一步优化基因结构 [55]。

基因功能注释：采用 Blastp 分别比对瑞士蛋白库（Swiss-Prot）、非冗余蛋白库（NR）、京都基因与基因组百科全书（KEGG），\\(E\\text{-value}\\)阈值设为\\(10^{-5}\\)。使用 InterProScan70（v5.31）[56] 检索 Pfam、InterPro 数据库，预测蛋白保守基序与结构域，并依据 InterPro 注释结果匹配获得各基因的基因本体（GO）编号。

比较基因组分析

下载丹参 99–3、未知品系丹参、一串红、沟酸浆、芝麻、狸藻、油橄榄、番茄、马铃薯、人参、胡萝卜、拟南芥、毛果杨的基因组及注释数据。通过全序列双向蛋白比对，分析 shh 与其余 13 个物种的直系同源基因；运用 OrthoMCL 软件（参数-mode 3 -inflation 1.5）[57] 完成基因家族聚类；借助 CAFE 软件 [58] 统计同源基因家族的扩张与收缩情况。

针对单拷贝基因家族，使用 Muscle 软件 [59] 进行序列比对，再通过 Gblocks [60] 剔除比对结果中低可信度位点；利用 RAxML（v8.2.12）构建系统发育树。基于 PAML 软件包中的 mcmctree 程序（默认参数）[61] 估算物种分化时间。使用 MCScanX [62] 鉴定 shh 基因组内共线性区块，用于全基因组复制分析；调用 PAML 包内 codeml 程序，计算所有旁系同源基因对的同义替换率（\\(K_s\\)）。

代谢物检测

称取 0.1 g 新鲜样品粉末，加入 1 mL 甲醇，超声提取 20 min，8000 转 / 分钟离心 5 min；重复提取一次，合并两次上清液，经 0.22 μm 有机滤膜过滤。

采用超高效液相色谱（UPLC，美国沃特世） 结合 C18 色谱柱（粒径 1.7 μm，规格 2.1×100 mm）进行定量检测。检测波长 270 nm，柱温 25℃，流速 0.3 mL/min。流动相 A 为含 0.1%（体积分数）甲酸的纯水，流动相 B 为纯乙腈；梯度洗脱程序：0~5 min，B 相比例维持 40%；5~25 min，B 相比例由 40% 线性升至 60%。

代谢组分析采用赛默飞 Ultimate 3000 超高效液相色谱，搭配 Syncronis C18 色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm）。混合所有样品制备质控样，用于监测系统稳定性。色谱系统串联 Q Exactive 轨道阱质谱，配备电喷雾电离（ESI）源。质谱参数：正负离子同步扫描；喷雾电压 2.8 kV；鞘气流速 35 arb，辅助气流速 10 arb；毛细管温度 320℃。一级质谱分辨率 70000，扫描质荷比范围 70~1050；数据依赖型二级质谱分辨率 17500；阶梯式归一化碰撞能（NCE）设置为 20 V、40 V、60 V。

丹参酮合成相关基因分析

以拟南芥、丹参中参与甲羟戊酸途径（MVA）与甲基赤藓醇磷酸途径（MEP）的蛋白序列为查询序列，通过 BLASTP（\\(E\\text{-value} \\le 10^{-5}\\)）在 shh 基因组中检索同源基因。从美国国家生物技术信息中心（NCBI）下载丹参柯巴基焦磷酸合酶（CPS）、贝壳杉烯合酶（KSL）、CYP76AH1、CYP76AH3、CYP76AK1、CYP71D411、CYP71D375、CYP71D373 的基因序列；从丹参 99–3 基因组注释文件获取 2OGD 家族基因序列。

以上述序列为诱饵筛选 shh 同源基因，筛选条件：\\(E\\text{-value} \\le 10^{-50}\\)、序列一致性≥80%、序列覆盖度≥80%。将候选基因提交至 Pfam、SMART 数据库开展结构域分析，含有相同保守结构域即判定为同源基因。使用无参转录组定量软件 Salmon [63] 分析已发表转录组数据 [22]，获得丹参酮合成相关基因的表达量；采用 TBtools [64] 绘制表达热图。

Sm2OGD3 体外酶活实验

从丹参 99–3 成熟根中 PCR 扩增Sm2OGD3全长开放阅读框（ORF），并连接至 pET-30a 载体。将重组质粒转入大肠杆菌 BL21 (DE3) 菌株，置于 LB 液体培养基中 37℃培养，直至菌液\\(OD_{600}\\)达到 0.6；随后降温至 20℃，加入 0.5 mM 异丙基 -β-D – 硫代半乳糖苷（IPTG），20℃诱导表达 20 h。

收集 100 mL 菌液菌体，4℃条件下重悬于 15 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2~7.4，含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠）[65]。采用 187.5 W 功率超声破碎菌体（工作 3 s，间歇 10 s，总时长 30 min），离心后获取粗酶液。

反应体系总体积 0.5 mL，以 PBS 为缓冲液，依次加入 160 μM 2 – 氧代戊二酸、50 μM 硫酸亚铁、10~100 μM 底物，30℃孵育 0.5~1 h [65]。以转入空 pET-30a 载体的大肠杆菌粗酶液作为阴性对照。反应结束后，用 0.5 mL 乙酸乙酯萃取产物两次，氮吹仪吹干有机相；残渣用 0.2 mL 甲醇复溶，过滤后采用沃特世液质联用仪（UPLC-ESI-MS）检测。使用 MssLynx V4.1 软件分析二级质谱数据。

Sm2OGD3 转基因功能验证

PCR 扩增Sm2OGD3全长 ORF，先连接至 pTOPO-Blunt 载体，经桑格测序验证序列无误后，使用限制性内切酶 BstE Ⅱ 与 Nco Ⅰ 双酶切，将目的片段插入 pCAMBIA1391 载体。利用发根农杆菌 ACCC10060 侵染丹参，参照魏氏方法诱导获得转基因毛状根 [66]。

采用上游引物 35S-F、下游引物 Sm2OGD3-R 进行 PCR 阳性鉴定。将 PCR 鉴定阳性的毛状根转入 6,7-V 液体培养基，每 3 周继代培养一次。培养三个月后收获样品，液氮速冻；取 0.2 g 冻存样品研磨成粉末，加入 1 mL 甲醇提取，提取液吹干后用 0.2 mL 甲醇复溶，过滤后通过超高效液相色谱检测丹参酮含量。