🧪 前期准备
实验动物：为获得高活性的细胞，出生后1~3天龄的小鼠。
试剂与耗材：准备好解剖器械、培养基（如DMEM）、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、以及培养皿、离心管、细胞筛网等。
📋 主要操作步骤
1. 组织获取（开眶取视神经）
在手术显微镜下，通过经颅开眶法或经眼眶外侧开眶法获取P2期小鼠的管内段视神经，长度约2mm。建议将获取的组织立即放入预冷的无菌PBS中清洗，并去除表面附着的血液和结缔组织。
黄色圈中的突出部分为视神经组织
视网膜突出部分为视神经组织
2. 组织块法原代培养
将处理好的视神经组织剪成约1mm³大小的碎块，均匀地贴附在培养瓶底壁上，培养箱内倒置放置2-4小时，使组织块牢固贴壁。之后，小心加入含10% FBS的DMEM完全培养基，再放回培养箱中继续培养。这个过程通常会使混合胶质细胞（主要是星形胶质细胞和少突胶质细胞）从组织块中迁移并增殖，培养约7天时，细胞会出现明显的分层现象：星形胶质细胞在底层，少突胶质细胞前体细胞散在分布在上层。
3. 振荡法分离纯化（混合胶质细胞培养的关键步骤）
为了获得高纯度的星形胶质细胞或少突胶质细胞，需要对其进行分离纯化。振荡法是核心手段：
原理：利用星形胶质细胞贴壁牢固，而少突胶质细胞前体细胞贴壁相对松散的特点。
操作：待细胞融合度合适后，将培养瓶置于恒温摇床上，以特定速度（如200-250 rpm）振荡一段时间（如16-18小时）。
结果：
上清液中悬浮的细胞即为少突胶质细胞前体细胞（O-2A祖细胞），可以通过离心收集。
贴壁在瓶底的细胞主要为星形胶质细胞，可继续培养或传代。
5. 细胞鉴定
无论培养何种细胞，都需要通过免疫细胞化学（如免疫荧光、免疫组化）对细胞身份进行最终确认：
GFAP免疫荧光鉴定
星形胶质细胞：通常表达GFAP或S100β等标志物。
少突胶质细胞（成熟）：通常表达MBP或O4等标志物。
少突胶质细胞前体细胞（O-2A祖细胞）：通常表达神经节苷脂GD3。
此外，也可用流式细胞术对细胞纯度进行定量分析。
