PEI转染细胞状态不佳？活率下降、结团与碎片的排查与优化|HEK293T与悬浮细胞PEI转染

摘要： PEI是哺乳动物细胞瞬时转染中常用的阳离子聚合物载体，实验中可能出现细胞活率下降、结团、碎片或絮状物增多等现象。本文区分三类异常表现，围绕复合物用量与配比、细胞状态、稀释环境及试剂配制分析可能原因，并介绍观察判断和系统排查方法，为质粒转染、瞬时蛋白表达及相关研究中的PEI条件优化提供参考。

关键词：PEI转染、聚乙烯亚胺、细胞活率、转染复合物、转染细胞结团、瞬时转染、HEK293T、DNA–PEI比例、悬浮细胞转染

PEI（聚乙烯亚胺）是哺乳动物细胞瞬时转染中常用的阳离子聚合物载体。它操作相对简便、成本较低，经过体系优化后可用于从培养皿到生物反应器的不同培养规模，在实验室研究和瞬时蛋白表达中应用较多。PEI通过与DNA形成复合物参与递送，其实际表现与产品类型、细胞状态及培养方式密切相关。

在条件匹配的体系中，PEI转染能够兼顾较好的细胞活率与表达表现。实际操作中遇到的活率下降、细胞结团或碎片增多，可能涉及PEI用量相关的细胞毒性、细胞起始状态、复合物制备或培养条件，需要结合异常发生的时间判断。把这些现象分开观察，再针对对应环节调整，有助于建立更稳定、可重复的转染流程。

一、先分清三类现象

细胞活率下降、细胞结团和培养液中碎片增多，虽然可能同时出现，但排查重点不同。活率下降需要结合复合物用量和细胞承受能力判断，结团需要区分复合物聚集与细胞自身因素，而碎片或絮状物则要回看它们是在细胞状态改变之前还是之后出现。下表保留了三类现象的常见时间关系和主要排查方向，实际判断仍需结合显微观察及活率记录。

表1：PEI转染中活率下降、结团与碎片的排查与优化。

真正的细胞碎片通常是细胞受损后的结果，但培养液中看起来像碎片的物质，也可能来自试剂析出或复合物聚集。因此，观察到碎片或絮状物增多时，先确认细胞状态从何时开始变化，并检查加入细胞之前的制备液，往往比直接处理可见颗粒更有助于找到原因。

二、活率下降：多为条件失衡的信号

在优化好的体系中，PEI转染可以维持较好的细胞状态。如果转染后活率明显下降，应检查是否有某项条件超出了当前细胞和培养体系的适用范围。复合物用量、PEI/DNA比例、细胞起始状态以及培养液条件，是需要结合起来评估的几个方面，不能在排查前就排除PEI本身的剂量相关影响。

（一）复合物用量或比例需要调整。 PEI与DNA结合后，体系中可能仍有未结合的游离PEI，其多少取决于配比及制备条件。当PEI用量偏高时，可能增加其与细胞膜相互作用带来的细胞损伤风险。不同细胞系以及不同类型PEI，包括线性或支化结构、不同分子量和具体产品配方，适用的用量区间并不相同。因此，可以固定细胞密度，在小范围内比较DNA用量与PEI/DNA比例，寻找兼顾活率和转染效果的条件。

图1：不同条件下HEK293T细胞的GFP表达，组别标注沿用原图：Control、PEI（1:2）、PEI（1:3）。图片来源：Akgöl等，2021[1]。

图1展示的是GFP表达图像，可作为比较转染条件的参考，但不能单独用于判断细胞活率或确定通用配比。实际优化时，应在相同观察条件下同时记录表达和活率，并明确实验方案中DNA与PEI的比例顺序及计量方式，使不同批次结果能够相互比较。

（二）细胞状态与密度。 处于对数生长期、起始活率较高的细胞，更适合用于建立稳定的转染条件；细胞生长状态变差、贴壁培养汇合度过高，或长期传代后状态发生变化时，转染后更容易出现异常。转染时应把细胞密度控制在适合该细胞系和培养方式的范围内，同时观察形态、活率及分散情况，避免将转染前已经存在的问题归因于某一个转染参数。

（三）培养液与营养状态。 当培养液已经耗竭、营养支持不足时，细胞接受转染处理后的状态可能进一步受到影响。对于允许更换培养液的体系，转染前使用新鲜培养液是可以优先评估的调整；复合物是否聚集，则还需要同时检查培养液和稀释液组成、混合过程及孵育条件。将细胞培养状态与复合物稳定性分别观察，有助于避免把不同问题归为同一原因。

（四）正确看待用量与转染效果的关系。 PEI的阳离子特性是其结合、压缩DNA并参与细胞递送的基础，因此优化目标不是一味减少PEI，而是找到表达效果和细胞活率均较合适的区间。有研究在去除游离PEI后观察到细胞毒性降低，但在较低DNA用量下，基因递送效果也随之下降[2]，说明用量调整需要兼顾两个方面。对于Polysciences PEI 25K、PEI MAX等产品，可结合PEI转染相关技术资料核对具体产品与应用条件，再开展小范围比较。

三、细胞结团：先判断团块成因

（一）复合物聚集。 DNA–PEI复合物的稳定性对稀释环境较为敏感。相关研究在特定配方中观察到，PBS条件下出现复合物粒径增大或聚集，而相应NaCl条件下未出现同样的失稳现象[3]。这提示缓冲液组成需要纳入排查，但不能将PBS或氯化钠溶液的表现推广到所有体系。应选择与具体PEI产品和培养方案相匹配的稀释液，统一制备流程，并在完成规定孵育后及时使用。

（二）复合物的桥连作用。 带正电的复合物可能与细胞表面发生多位点相互作用，使相邻细胞靠拢，可作为解释部分转染后结团现象的可能机制。对于悬浮培养中出现的团块，应同时检查复合物是否已经聚集，以及细胞在转染前是否已有成簇倾向，避免仅根据团块外观就认定某一种机制。

（三）细胞自身的生长性结团。 部分细胞系在悬浮培养中本身倾向于聚集，适合该细胞系的分散状态有助于复合物与细胞更均匀地接触。较明显的结团可能影响转染表现，因此应在转染前维持良好的细胞生长状态，并关注细胞密度和活率。减少细胞受损，也有助于降低细胞内容物释放后进一步加重聚集的可能性。

区分方法

观察时可以先看团块中是否存在形态完整的细胞：若存在，应考虑细胞聚集参与其中；若主要是折光颗粒或絮状物，则优先检查复合物制备。随后确认团块出现于加入复合物之后，还是在转染前已经存在，后者应先处理细胞培养状态。如果镜下先出现絮状物、后出现细胞结团，可以将复合物聚集列为优先排查方向，并结合未接触细胞的制备液及细胞活率继续判断。

抗结团剂的使用注意

悬浮培养中可以根据细胞体系使用抗结团剂，但部分产品可能干扰阳离子转染过程。例如，Gibco Anti-Clumping Agent说明书明确提示其会干扰PEI等瞬时转染试剂，不应在转染阶段使用[4]。因此，已经使用抗结团剂的培养体系，需要按具体产品和细胞方案安排去除及后续恢复使用的时间，不能把常规培养中的添加方式直接套用到转染步骤。

四、碎片：多为结果，重点在前端

培养液中的可见碎片或颗粒，可优先从两类来源进行排查。第一类是细胞裂解后的残留物及释放的核酸，可能表现为黏丝状物质或边缘不规则的团块，通常需要结合此前的细胞状态变化判断。减少这类物质的持续产生，重点是改善前端的细胞培养和转染条件，而不是仅在终点去除漂浮物。

第二类是未充分溶解或析出的PEI及复合物，可能呈细小颗粒或折光物，出现时间也可能早于细胞变化，甚至在加入细胞之前。遇到这种情况，应核查母液配制与保存状态，再检查复合物的稀释、混合和孵育过程。判断时可以记录颗粒是否早于细胞异常出现，以及换液后是否减少，但外观和换液反应都只是线索，应结合制备液检查确认问题所在。

五、系统优化，让转染更稳定

遇到细胞状态不佳时，按顺序梳理条件，比在单一参数上反复调整更容易解释结果。首先可以固定细胞密度，设置少量梯度比较DNA用量和PEI/DNA比例，以活率与转染效果均较合适的区间作为后续候选条件。用量比较过程中，应保持细胞来源、培养状态和复合物制备流程一致，使观察到的差异能够对应到正在调整的因素。

基础条件方面，应选用传代状态受控、处于对数生长期、起始活率较高的细胞，统一复合物制备流程，使用合适的稀释液并在完成规定孵育后及时使用。必要时可评估转染前更换新鲜培养液；对于适合换液的体系，也可将转染后18–24小时换液纳入比较。换液时间应与细胞培养方式和具体转染方案相匹配，不能作为所有表达体系的统一要求。

如果调整PEI用量后，活率与转染效果只是一升一降，说明还需要从细胞状态、复合物制备和培养条件等方面继续排查，而不是持续围绕同一个参数增减。具体用量、比例和时间会随细胞系、PEI产品类型及培养方式变化，按“细胞状态—复合物制备—培养条件”的顺序逐步核查，再以活率和表达结果共同评价，有助于形成稳定、可重复的实验条件。

图2：PEI转染优化流程。

参考文献与技术资料

[1] Akgöl S, Yetim E, Kalkan BM, Kocabaş F. Development of gene editing strategies for CCR5 gene in endothelial cells. Gene Editing. 2021;2:22–30. DOI：10.29228/genediting.54872。

[2] Boeckle S, et al. Purification of polyethylenimine polyplexes highlights the role of free polycations in gene transfer. The Journal of Gene Medicine. 2004;6(10):1102–1111. DOI：10.1002/jgm.598。

[3] Montaño González PA, et al. Key Molecular Parameters of PEI for Efficient DNA Delivery Into HEK293T Cells. Macromolecular Chemistry and Physics. 2026;227(18):e70343. DOI：10.1002/macp.70343。

[4] Thermo Fisher Scientific. Anti-Clumping Agent产品说明书，Publication Number MAN0009950，Rev. 1.00。

关于技术来源

本文基于PEI转染公开研究、Polysciences PEI 25K与PEI MAX相关产品资料及细胞培养技术说明，由曼博生物MineBio整理，用于哺乳动物细胞瞬时转染、重组蛋白表达及病毒载体包装相关研究中的条件优化参考。文中涉及活率下降、结团和碎片的判断，应结合细胞状态及复合物制备过程理解；具体用量、比例和换液时间需按所用细胞与试剂体系确定。