往期，我们分享过不少文献或者项目文章，越来越多的研究者选择进行双组学或者多组学策略，其中ATAC-seq+RNA-seq的组合成了很多老师的选择的黄金组合。ATAC-seq和RNA-seq作为两种探究生命活动机理的技术手段已经被广泛应用。
ATAC-seq研究DNA染色质开放区域，目的在于研究特定时空下基因组中所有活跃转录的调控序列，RNA-seq则是从RNA层面上对基因的表达情况进行阐述，探究不同基因在不同条件下的表达差异。将ATAC-seq与RNA-seq联合分析，可以将目的基因开放区域以及该基因的表达模式进行阐述，更好地对生命活动机理进行解释。
今天我们来聊聊如何将ATAC-seq和RNA-seq进行联合分析。
一 重叠分析——ATAC-seq关联基因和RNA-seq差异基因overlap
相关性分析（Correlation Analysis）确实是ATAC-seq和RNA-seq联合分析的“基石”。相关性分析中最常见的分析就是重叠分析。
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（1）重叠分析 (Venn图/Upset图)：将ATAC-seq鉴定到的差异开放区（DARs）关联到最近的基因，然后与RNA-seq鉴定到的差异表达基因（DEGs）取交集。找到那些“染色质既发生开闭变化，表达量也随之改变”的基因集。
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（2）联合散点图/九象限图：这是一个非常经典的图表。纵轴表坐标是ATAC-seq的差异倍数（Log2FC），横坐标是RNA-seq的差异倍数（或者倒过来）。通过这张图，可以直观地看到基因调控的正相关趋势（例如：染色质越开放，基因表达量越高；染色质关闭，表达量下降）。
二 联合富集分析 (GO/KEGG)
对重叠的基因进行功能富集分析。这样相当于我们限定了条件——“这个基因必须在染色质物理结构上发生了开闭变化（ATAC），同时表达量也改变了（RNA）”，这样剔除了大量处于下游、间接被调控的基因。
下图的案例中，先是基于相关性分析证实了染色质开放度与基因表达之间存在正相关关系（图B），表明转录激活过程与染色质重塑密切相关。整合分析（重叠分析）共鉴定出909个差异表达基因与启动子相关DARs重叠，其中753个基因同时表现出染色质可及性增加和mRNA水平升高（图C）。然后对这些基因进行KEGG富集分析，在容受性建立相关的关键生物学过程中富集，包括细胞粘附、免疫调节和子宫重塑。（图C）。
三 核心转录因子（TF）挖掘
（1）Motif富集分析+表达量过滤
首先，在ATAC-seq的差异开放区（特别是上调的区域）寻找富集的TF结合基序（Motif）。然后，关键的一步来了：把这些预测到的TF拿到RNA-seq数据中去验证。如果某个TF的Motif大量富集，且该TF本身的基因表达量（RNA-seq数据）在胁迫下也发生了显著上调，那么它极有可能就是我们要找的核心调控因子（如NAC、WRKY、bZIP、MYB等家族）。
（2）足迹分析（Footprinting分析）
相比于简单的Motif预测，足迹分析能进一步在测序深度图上看到转录因子“真实结合”留下的凹陷（Footprint），为TF的活性变化提供更直接的表观遗传证据。
四 构建“TF-靶基因”调控网络：把故事串联成线
找到核心转录因子TF只是单点突破，把上下游串联起来才能形成完整的机制网络。
靶基因预测与筛选：以挖掘到的核心TF为中心，去寻找它的靶基因。条件是：这个靶基因的启动子区必须有该TF的结合位点（ATAC peak + Motif），并且靶基因的表达模式要与TF具有相关性（比如TF上调，靶基因也上调）。
网络图可视化(Cytoscape)：将上述关系导入软件Cytoscape，绘制出一个漂亮的“Hub TF-Target genes”调控网络图。这往往是一篇高分文章的“门面图”，能直观展示这个TF是如何通过调控下游一系列功能基因来发挥功能的。
五 IGV基因组可视化验证
在锁定了一两个关键的TF或重要的功能基因后，通常可以用IGV（Integrative Genomics Viewer）将它们在基因组上的表现直观地画出来。
Track图拼接：把ATAC-seq的峰图（Peak track）和RNA-seq的表达量图（Read density track）上下对齐展示。比如说，在干旱处理后，某某关键基因启动子区域的ATAC peak信号显著增强（染色质变得开放），同时底部的RNA-seq转录本丰度也急剧上升，完美印证了表观层面的调控作用。
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参考文献
【1】Sun, Zhipeng, et al. "Multi-omics profiling of chromatin accessibility and H3K27ac reveals super-enhancer-mediated regulatory networks governing endometrial receptivity in goats." Journal of Animal Science and Biotechnology 17.1 (2026): 4.
【2】Tan, Wenhua, et al. "Integrative Analysis of ATAC-Seq and RNA-Seq Identifies Key Genes Affecting Muscle Development in Ningxiang Pigs." International Journal of Molecular Sciences 26.6 (2025): 2634.
