完整研究故事的诞生，离不开从靶点挖掘到分子验证的科学方法论支撑，而 AI 数字化虚拟筛选与精准的体外仪器验证手段的结合，正成为现代生物医学研究中发现新型靶向分子、解析药物作用机制的新兴路径。
本次为大家分享一篇“虚拟筛选-体外验证-体内模型-机制探究”的研究文章。
期刊：Theranostics
影响因子：13.3
发表单位：中国科学技术大学生命科学与医学部
摘要：本研究围绕动脉粥样硬化性心血管病（ASCVD） 的降脂治疗需求，以脂代谢关键酶ATP 柠檬酸裂解酶（ACLY）为靶点，从天然产物中筛选并鉴定出银杏叶来源的异银杏素（ISOGK），系统验证了其降脂、抗动脉粥样硬化的作用及机制，为心血管疾病治疗提供了新的天然候选药物。
研究详解
01 ISOGK作为天然ACLY抑制剂的发现
为筛选潜在的ACLY抑制剂，采用虚拟筛选技术对包含3200个天然产物的化合物库进行分子对接分析（图1A）。基于对接结果中预测的最低结合自由能，对候选化合物进行排序，以评估其与ACLY的结合亲和力（图1B）。通过ADP-Glo测定试剂盒在体外测量，选择ISOGK作为潜在的天然ACLY抑制剂用于进一步研究（图1C）。ISOGK是一种双黄酮化合物（图1D）。CCK-8结果表明，ISOGK在浓度低于7.5 μmol/L时对原代小鼠肝细胞和HepG2细胞系没有显著的细胞毒性（图1E,F）。然后分离来自喂食16周高脂肪饮食的小鼠的原代肝细胞，并用不同浓度的ISOGK处理。尼罗红染色结果显示，ISOGK处理降低了肝脏脂质水平（图1G,H）。这些数据表明，ISOGK作为ACLY的天然抑制剂发挥作用，并在体外发挥降脂作用。
图1 发现ISOGK作为天然存在的ACLY抑制剂
02 ISOGK对Apoe-/-小鼠动脉粥样硬化的抑制作用
为探究ISOGK对动脉粥样硬化的作用，在第7周对饲喂高胆固醇饮食的雄性和雌性载脂蛋白E基因敲除（Apoe-/-）小鼠进行异银杏素腹腔注射给药（图2A）。与DMSO对照组相比，雄性和雌性小鼠的体质量均未出现显著变化（图2B）。此外，血清丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平检测结果显示，雌雄小鼠的该指标均无明显改变（图2C）。
以 20 mg/kg/天的剂量给小鼠腹腔注射ISOGK并持续8周后，经ORO染色观察发现， Apoe-/-小鼠的主动脉全血管面斑块面积有所减少。与DMSO对照组相比，ISOGK处理组的雄性小鼠主动脉斑块病变面积显著减少7.21%，雌性小鼠减少3.88%（图2D,E）。对主动脉窦进行ORO染色分析显示，ISOGK处理组的雄性和雌性 Apoe-/-小鼠，其主动脉窦病变面积较DMSO对照组分别显著减少46.35%和45.74%（图2F,G）。此外，经H&E染色可见，箭头所指为主动脉窦部位的坏死核心区域；实验结果表明，ISOGK处理组小鼠的该坏死核心面积也出现显著缩减（图2F,G）。
图2 ISOGK减轻雄性和雌性Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化
03 ISOGK调节Apoe-/-小鼠脂质代谢而不影响氧化应激
为探究ISOGK对肝脏脂质代谢的调控作用，对DMSO对照组和Apoe-/-小鼠的肝脏样本进行了转录组测序（图3A）。对两组小鼠肝脏的转录组测序结果进行对比分析发现，共有 201 个基因呈现差异表达（图3B）。热图分析结果显示，经ISOGK处理后，与脂肪酸和胆固醇生物合成相关的基因（包括 Srebf1、Fasn、Acaca 和 Cyp51）均显著下调，而部分与脂肪酸氧化相关的基因则显著上调（图3C）。GO 富集分析结果显示差异基因主要参与脂肪酸代谢过程和类固醇代谢过程的调控（图3D）；此外，KEGG 通路富集分析表明，差异基因在胆固醇代谢通路中高度富集（图3E）。ISOGK处理组小鼠的脂肪酸降解和脂肪酸代谢通路被显著激活，同时固醇生物合成通路受到抑制，这与ISOGK通过抑制ACLY发挥脂质调控作用的机制相吻合（图3F）。
图3 ISOGK调节Apoe-/-小鼠肝脏的脂质代谢
04 ISOGK对高脂血症小鼠和仓鼠的降脂作用
ISOGK处理导致雄性和雌性小鼠血清和肝组织中胆固醇（TC）水平的统计学显著降低（图4A）。经ISOGK处理后，极低密度脂蛋白（VLDL）颗粒中的甘油三酯（TG）和胆固醇含量明显降低（图4B）。选取 8 周龄仓鼠，先给予高胆固醇饮食饲喂 2 周，再对其进行ISOGK腹腔注射给药，持续给药 4 周后处死实验动物。治疗4周后，血清TC、TG和LDL-C水平显著降低，肝脏脂质水平显著降低（图4C,D）。FPLC分析证实了在ISOGK处理的仓鼠中血清TC和TG分布的显著降低（图4E），用ISOGK处理还显著降低仓鼠肝脏中的脂质沉积（图4F-G）。
图4 ISOGK在高脂血症小鼠和仓鼠中显示出降脂作用
05 ISOGK减轻高胆固醇饮食诱导的Ldlr-/-仓鼠高脂血症和动脉粥样硬化
将低密度脂蛋白受体基因敲除（Ldlr⁻/⁻）仓鼠随机分为三组：载体组、低剂量ISOGK组（2 mg/kg/天）和高剂量ISOGK组（5 mg/kg/天）。在治疗期结束时，将仓鼠安乐死（图5A）。在低、高剂量的ISOGK处理的仓鼠中观察到显著降低（图5B）。对血清血脂谱的分析结果显示，低、高剂量ISOGK处理均能显著降低TC和TG水平（图5C）。对主动脉进行ORO染色的结果显示，与DMSO对照组相比，低剂量和高剂量ISOGK处理组的斑块面积显著减少（图 5D,E）。同样，对主动脉窦的ORO染色以及对肝脏组织的尼罗红染色结果均表明，ISOGK能显著减少Ldlr-/-仓鼠体内的脂质沉积（图 5F,H）。
图5 ISOGK改善Ldlr-/-仓鼠的高脂血症和动脉粥样硬化
06 ISOGK通过抑制ACLY活性改善高脂血症
为了评估ISOGK对从头脂肪生成的影响，将原代小鼠肝细胞与ISOGK孵育4小时。结果表明，2.5和5 μmol/L的ISOGK对脂肪生成有明显的抑制作用（图6A）。ADP-Glo测定结果显示，ISOGK有效抑制ACLY酶活性（图6B）。通过测量三种高脂血症模型动物的肝组织中的酶活性，ISOGK处理在体内也显著抑制ACLY活性（图6C-E）。
分子对接分析显示，ACLY的结合口袋中存在R66、H113、Q115、E118、N203和P204，ISOGK可与这些残基发生相互作用（图6F）。通过表面等离子体共振（SPR）验证了ISOGK与ACLY的直接相互作用（图6G）。细胞热迁移测定（CETSA）分析还表明，ISOGK在温度诱导的变性期间稳定ACLY蛋白（图6H-I）。
图6 ISOGK在体外和体内抑制ACLY活性
07 ISOGK对Apoe-/-小鼠的抗动脉粥样硬化和降脂作用具有ACLY依赖性
采用GalNAc-siAcly（GalNAc偶联的Acly靶向siRNA），在饲喂高胆固醇饮食 15 周的Apoe-/-小鼠体内，实现了肝脏组织中 Acly 基因的敲低。ISOGK从实验第7周开始给药，持续8周（图7A）。WB检测结果显示，GalNAc-siAcly 处理组小鼠肝脏中的ACLY蛋白水平显著降低，而肾脏中的 ACLY 蛋白水平未出现明显变化（图7B）。与对照组相比，ISOGK处理的Apoe-/-小鼠的主动脉斑块大小显著降低。在Acly敲低组的小鼠中，斑块面积没有被ISOGK进一步减小（图7C）。ORO染色和H&E染色在主动脉窦中的分析揭示了ISOGK处理组的病变面积和坏死核心面积显著减小。然而，在Acly敲低Apoe-/-小鼠中未观察到ISOGK治疗对动脉粥样硬化的作用（图7D,F）。此外，在Acly敲低Apoe-/-小鼠中未进一步观察到ISOGK的降脂作用（图7G）。总之，结果表明ISOGK的抗动脉粥样硬化和降脂作用依赖于ACLY抑制。
图7 ISOGK对Apoe-/-小鼠的抗动脉粥样硬化和降脂作用具有ACLY依赖性
总结
本研究以动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）的核心危险因素高胆固醇血症为切入点，瞄准ACLY这一潜力药物靶点，遵循“靶点导向虚拟筛选→体外活性与安全性验证→体内药效跨模型验证→分子作用机制解析→靶点依赖性确证”的天然产物创新药开发经典思路，系统发掘并验证了ISOGK作为 ACLY 抑制剂的降脂与抗动脉粥样硬化活性，为心血管疾病创新药物研发提供了完整的实验范式与候选药物。
参考文献
Zhang Z, Chen M, Xu Y, et al. A natural small molecule isoginkgetin alleviates hypercholesterolemia and atherosclerosis by targeting ACLY[J]. Theranostics, 2025, 15(10):4325-4344. doi:10.7150/thno.105782.
